CRISPR-Cas System: Et lovende diagnoseverktøy for Covid-19

Abstrakt

Mer enn ett år har gått siden begynnelsen av den nye pandemien med koronavirussykdommer (COVID-19) i 2019, som har skapt enorme problemer globalt som påvirker alle aspekter av menneskers liv. På grunn av fremveksten av nye stammer av SARS-CoV-2, gjenstår pandemisk risiko, til tross for starten av vaksinasjonen. Derfor er raske diagnostiske tester avgjørende for å kontrollere infeksjon, forbedre klinisk behandling og stoppe spredningen av sykdommen. Nylig har CRISPR-baserte diagnoseverktøy muliggjort rask diagnostikk. Her gjennomgår vi diagnoseapplikasjonene til CRISPR-Cas-systemet i COVID-19.

Nøkkelord: COVID-19, CRISPR-Cas-systemer, SARS-CoV-2

Gå til:

Introduksjon

I desember 2019 dukket et nytt beta-korona-virus kalt alvorlig akutt respiratorisk syndrom-relatert koronavirus (SARS-CoV-2) opp i Wuhan, Kina og spredte seg raskt over hele verden. Etter alvorlig akutt respiratorisk syndrom-relatert koronavirus (SA-RS-CoV) og Midtøsten respiratorisk syndrom Coronavirus (MERS-CoV), er SARS-CoV-2 det tredje zoonotiske koronaviruset som er ansvarlig for pandemien i det nåværende århundret. SARS-CoV-2 forårsaker koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) 1 – 4 . Til dags dato, ifølge rapporter fra Verdens helseorganisasjon (WHO), har mer enn 100 millioner mennesker blitt smittet med COVID-19, og mer enn 2 millioner mennesker over hele verden har dødd av sykdommen. SARS-CoV-2 er et positivt+ sanse-RNA-virus med et stort genom på omtrent ~27 til ~32 kb. SARS-CoV-2 tilhører Coronaviridae-familien, som kan infisere et bredt spekter av fugler og pattedyr som mennesker. På grunn av deres brede vertsområde og høyfrekvente rekombinasjon i koronavirus, er generering av høyvirulente virus vanlig i denne familien. De vanligste menneskelige koronavirusene som kan forårsake en mild infeksjon som forkjølelse hos mennesker inkluderer Human Coronavirus NL63 (HCoVNL63), Human Coronavirus 229E (HCoV-229E), Human Coronavirus OC43 (HCoV-OC-43) og Human Coronavirus HKU1 (HCoV) -HKU1) ^{1 , 2 , 5}. Før 2003 ble medlemmer av denne familien antatt å forårsake bare en mild luftveissykdom hos mennesker, men fremveksten av nye koronavirus SARS-CoV i 2003, MERS-CoV i 2012 og den siste SARS-CoV2 i 2019 indikerte at de kan forårsake alvorlig akutt respiratorisk syndrom 6 . Til dags dato har flere legemidler som Remdesivir, Dexamethason og inhalert interferon-beta blitt lisensiert basert på resultatene av randomiserte kontrollerte studier 7. I tillegg har nylige suksesser i utviklingen av COVID-19-vaksine og utbruddet av vaksinasjon mot SARS-CoV-2 vakt håp om en slutt på pandemien. Ikke desto mindre, på grunn av høy smittsomhet av denne sykdommen under inkubasjonsperioden og fremveksten av nye stammer av SARS-CoV-2, utvikler COVID-19 seg fortsatt globalt og er fortsatt et alvorlig helseproblem 1 , 8 . Derfor er rimelige, nøyaktige og raske metoder for påvisning av COVID-19 nødvendig for raskt å identifisere infiserte mennesker og isolere dem for å unngå ytterligere spredning av dette viruset og redusere risikoen for overføring av sykdom.

Ulike teknikker, inkludert RT-qPCR, sekvenseringsbaserte metoder og immunologiske metoder har blitt brukt for å diagnostisere SARS-CoV-2. Begrensningene som lav nøyaktighet og følsomhet ved prøvepreparering, reagenser, utstyr og forskjellige typer kliniske prøver har begrenset de vanlige metodene for å oppdage SARS-CoV2 (RT-PCR, serologi); derfor er ytterligere forskning nødvendig for å finne rimelige metoder med høy følsomhet for å oppdage SARS-CoV2 9 – 11. På denne måten kan det nyeste CRISPR-Cas [Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRIS-PR Associated System (CAS)] utnyttes til å utvikle diagnostiske eller terapeutiske tilnærminger. CRISPRCas er en del av bakteriell ervervet immunsystem i forsvar mot fager og invaderende genomer. CRIS-PR-Cas-systemet består av to deler, inkludert CRISPR-array og Cas-proteiner. CRISPR er en rekke korte gjentatte sekvenser i genomet til bakterier, separert av DNA-fragmenter kalt spacere. Disse spacerne stammer fra fagen eller invaderende genomer, som møter bakteriegenomet. Cas-proteinene er svært forskjellige og utfører mange funksjoner, inkludert nuklease, helikase , etc. CRISPR array fungerer som et minne for å gjenkjenne smiende genomer og Cas-proteiner som Cas 9 som ødelegger fremmede genomer12 – 16 . En dypere forståelse av CRISPR-Cas-biologien kan lette utviklingen av nye diagnostiske og terapeutiske verktøy og strategier innen smittsomme sykdommer.

CRISPR-Cas-teknologien gir løfter om å diagnostisere nøyaktig og behandle infeksjonssykdommer som virus- og bakteriesykdommer. I denne forbindelse har flere studier vist potensialet til CRISPR/Cas-teknologi i behandling og diagnostisering av virusinfeksjoner (human immunsviktvirusinfeksjon, hepatittvirusinfeksjoner, etc.) og bakterielle infeksjoner ( Escherichia coli , etc. ) 17 – 20 . Raske og nøyaktige diagnostiske tester letter tidlig gjenkjennelse og behandling av infeksjonssykdommer. Til dags dato har forskjellige varianter av CRISPR-systemene blitt introdusert for molekylær påvisning av infeksjonssykdom. I denne gjennomgangen har vi fokusert på bruken av CRISPR-Cas-systemet for COVID-19-diagnose21 , 22 .

CRISPR-teknologi for tidlig oppdagelse

De siste årene har en svært sensitiv, presis og rask teknologi kalt CRISPR-Cas-systemet forårsaket en revolusjon innen genomredigering. Dessuten er CRISPRCas-systemet et veletablert genomredigeringsverktøy; det er rapportert at det kan muliggjøre rask påvisning av nukleinsyren. Det er to hovedklasser av CRISPR-Cas-systemer basert på Cas-protein: Klasse 1 (type I/cas3, III/cas10 og IV) og Klasse 2 CRISPRCas-system (II/Cas9, V/Cas12 og VI/Cas13) 15 , 23. Klasse 1 CRISPR-Cas-systemer utnytter komplekser med flere underenheter for å identifisere og spalte målsekvensen, mens klasse 2-systemer bruker et enkelt-underenhets-Cas-protein for å gjenkjenne og spalte målsekvensen. Nylig har flere typer Cas-proteiner som Cas9, Cas12 og Cas13 som tilhører klasse 2 CRISPR-Cas-systemet blitt brukt for påvisning av nukleinsyre. Cas9- og Cas12-endonukleaseenzymer er i stand til å kutte dobbelttrådet DNA (dsDNA), mens Cas13 retter seg mot RNA, i motsetning til Cas9 som blir en inaktiv tilstand etter målspaltning. Nukleaseenzymaktiviteten til Cas12 og Cas13 forblir aktiv etter målretting av ønskede sekvenser og kan spalte både mål- og ikke-målsekvensene. Derfor, hvis målsekvensen er tilstede i en prøve, blir disse enzymene aktivert og vil begynne å kutte uten å stoppe. Dermed, nukleasemediert nedbrytning av ikke-målsekvenser merket med et fluoroforfargestoff kan produsere fluorescerende signaler som kan fungere som en indikator for å bestemme de ønskede nukleinsyrene. Derfor kan disse nukleasene utnyttes for nukleinsyredeteksjon15 , 23 – 25 . Til dags dato har flere lovende tilnærminger blitt utviklet basert på CRISPR-teknologi for tidlig diagnose av COVID-19, for eksempel Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK) system, DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system, FnCas9 Editor Linked Uniform Deteksjonsanalyse (FELUDA), Cas3-Operated Nucleic Acid Detection (CONAN) og Variant Nucleotide Guard (VaNGuard).

SHERLOCK-analyse

CRISPR-Cas13a enzymbasert Covid-19-deteksjon:

For det første introduserte Feng Zhang og kolleger SHERLOCK for å oppdage RNA-virus som Zika- og Dengue -virus. I det nåværende COVID-19-utbruddet har Biosciences Company mottatt FDA-godkjenning for sin SHERLOCK-baserte COVID-19-deteksjonstest. Ved å bruke SHERLOCK-metoden kan dette selskapet oppdage flere gener av SARS-CoV-2 innen 1 time ^{11 , 26 – 28} . I denne metoden brukes Cas13 – et enzym som fungerer som en ribonuklease (RNase) og målrettet RNA – i stedet for DNA. Cas13-enzymet blir aktivert når det binder seg til RNA-mål viaspesifikke gRNAer. ^{Aktivert Cas13} fører til spaltning av RNA-målsekvenser og ikke-målreporter som omgir ssRNA og resulterer i produksjon av kvantifiserbare ^{signaler 11 , 26-29} . SHERLOCK-deteksjonsprotokollen inkluderer tre trinn:

1. Etter ekstraksjon av SARS-CoV-2 RNA fra pasientprøver, omdannes de ønskede sekvensene som S- eller ORF1ab -genet til SARS-CoV-2 til cDNA ved å bruke RT-RPA eller RT-LAMP, og deretter blir cDNA-er igjen transkribert til ssRNA ved hjelp av T7 transkripsjon.
2. Deretter legges CRISPR-Cas13-systemkomplekset inkludert Cas13-enzym, gRNA og fluorescensmerkede nukleotidsekvenser til det amplifiserte ssRNA. Etter gjenkjennelse av målsekvenser via gRNA, blir Cas13 aktivert og de fluorescerende reportersekvensene vil bli spaltet.
3. Til slutt avsløres det fluorescerende signalet som produseres ved spalting av RNA-reportere (Figur 1).Figur 1.Skjematisk av CRISPR-basert nukleotiddeteksjon (SHERLOCK)

DETECTR-analyse

CRISPR-Cas12a Enzymbasert Covid-19-deteksjon:

Et annet CRISPR-basert deteksjonssystem for COVID-19-infeksjon kalt DETECTR-teknologi er utviklet av Broughton et al basert på CRISPR-Cas 12 30 . For det første etablerte Chen et al DETECTR-teknologi i 2018 for å oppdage humant papillomavirus (HPV) 31 . Denne metoden er raskere enn SHERLOCK (~30 min ) og i motsetning til Cas13 brukt i SHERLOCK Cas12 i DETECTR gjenkjent dsDNA i stedet for ssRNA ^{9 , 15 , 32} . Etter SARS-CoV-2 RNA-ekstraksjon fra pasientprøver, inkluderer denne metoden tre trinn:

1. De ønskede sekvensene av det ekstraherte RNA, slik som E- og N- gener av SARS-CoV-2, blir revers transkribert og deretter isotermisk amplifisert ved bruk av RT-RPA eller RT-LAMP.
2. Deretter legges cDNA-amplikonene direkte til CRISPR-Cas 12-komplekset inkludert Cas12-enzym, gRNA og nukleotidsekvenser merket med et fluorescerende fargestoff. Cas12-enzymet binder seg til målsekvensen via gRNA; etter aktivering vil den spalte målsekvensen og reportermolekylene.
3. Til slutt genererer spaltning av reportermolekyler av Cas12 fluorescens, som kan visualiseres (Figur 2).Figur 2.Skjematisk av CRISPR-basert nukleotiddeteksjon (DETECTR).

FELUDA-analyse

CRISPR-Cas9 enzymbasert Covid-19-deteksjon:

Cas9-enzym er det mest populære genomredigeringsverktøyet. Cas9-enzym i kombinasjon med et spesifikt gRNA er i stand til å identifisere og spalte ønsket DNA-sekvens. Flere grupper har brukt CRISPR-Cas9 basert teknologi som et diagnostisk verktøy ved infeksjonssykdommer. Nylig har Azhar et al rapportert FnCas9-enzym for COVID-19-deteksjon; de kalte sin FnCas9-baserte metode FELUDA-analyse. FnCas9, et enzym med høy mismatchfølsomhet, finnes i Francisella novicida 33 , 34 .

Etter ekstraksjon av SARS-CoV-2 RNA fra pasientprøver, inkluderer denne metoden tre trinn:

1. Ekstraherte RNA-er omdannes til cDNA ved hjelp av revers transkriptase og forsterkes deretter ved bruk av biotinmerkede primere.
2. Deretter tilsettes FnCas9-komplekset inkludert sgRNA, FAM-merket tracrRNA og FnCas9-enzym til de biotinmerkede amplikonene. Binding av Ribonucleo-protein (RNP) FnCas9-kompleks merket med FAM til målsekvensene til positive prøver fører til aktivering av FnCas9-komplekset, noe som resulterer i spaltninger av FAM-merket tracrRNA.
3. Til slutt fører tilsetning av gullnanopartikler konjugert med FAM-antistoff til det forrige komplekset til akkumulering av antistoffspesifikk binding som følgelig gjør det ytterligere detekterbart (Figur 3).Figur 3.Skjematisk av CRISPR-basert nukleotiddeteksjon (FELUDA).

CONAN-analyse

CRISPR-Cas3 enzymbasert Covid-19-deteksjon:

Yoshimi et al har utviklet en type kollateral spaltningsbasert metode kalt Cas3-Operated Nucleic Acid Detection (CONAN) lateral flow-analyse, som letter rask (innen 40 minutter), rimelig og sensitiv påvisning av nytt koronavirus SARS-CoV -2 11 . Som nevnt ovenfor tilhører de CRISPR-baserte diagnostiske nukleinsyretestene hovedsakelig klasse 2 CRISPR, men CONAN lateral flow-analyse er basert på Cas3 nuklease, som tilhører klasse 1 CRISPR. Cas3 endonuklease, kan spalte de ønskede DNA-sekvensene. I motsetning til de enkle Cas12a- og Cas13-plattformene, trenger CONAN flere Cas-proteiner (Cas3, 5, 6, 7, 8 og 11) 11 , 23 . Etter ekstraksjon av SARS-CoV-2 RNA fra pasientprøver, inkluderer denne metoden tre trinn:

1. Den ønskede sekvensen til N- genet blir revers transkribert og amplifisert med RT-RPA eller RT-LAMP.
2. Deretter legges syntetisert cDNA til Cascade-crRNA-komplekset (inkludert Cas3, Cascade-proteiner, crRNA og ssDNA-reporterprobe). Cas3-enzymet binder seg til målsekvensen og blir aktivert. Den aktiverte Cas3 spalter målsekvensen og ssDNA-reporterproben.
3. Til slutt produserer spaltningen av reportersonden fluorescerende signaler, som er målbare (Figur 4).Figur 4.Skjematisk av CRISPR-basert nukleotiddeteksjon (CONAN).

VaNGuard-analyse

CRISPR-Cas12a-variant Enzymbasert Covid-19-deteksjon:

I likhet med andre RNA-virus har SARS-CoV-2 høye mutasjonsrater. Siden SARS-CoV-2 først ble identifisert for et år siden, har tusenvis av SARS-CoV-2-varianter som Storbritannia, Sør-Afrika, Brasilianske og indiske varianter blitt identifisert. Disse variantene er mer smittsomme og gjør det vanskeligere å kontrollere pandemien. På den annen side er slike mutasjoner vanskelig å oppdage med konvensjonelle metoder, derfor er tidlig påvisning av disse variantene sterkt nødvendig 35 , 36 . Nylig har et nytt diagnostisk verktøy, kalt Variant Nucleotide Guard (VaNGuard) blitt utviklet av et team av forskere fra Nanyang Technological University (Singapore). VaNGuard er en CRISPR-Cas 12-basert diagnostisk analyse som ved bruk av konstruert, da Cas12a-enzym kan oppdage villtype og mutert SARS-CoV-2 innen 30min . Dette enzymet (enAsCas12a), kan tolerere enkelt feiltilpasning når det brukes med SARS-CoV-2-målrettede gRNAer. I VaNGuard-teknikk brukes to forskjellige gRNA-er mot det ønskede SARS-CoV-2-genomet (for eksempel S- genet). To gRNA-er er designet for å målrette mot lignende sekvenser blant forskjellige varianter av SARS-CoV-2 35 , 36 .

1. Det ønskede SARS-CoV-2-genomet, for eksempel S- genet, blir reverstranskribert og amplifisert av RT-LAMP.
2. Deretter tilsettes syntetisert cDNA til Cascade-crRNA-komplekset inkludert: enAsCas12a, to forskjellige gRNA-er rettet mot S- genet og molekylet merket med et fluorescerende fargestoff). EnAsCas12a-enzymet binder seg til målsekvensen og blir aktivert. Den aktiverte enAsCas12a spalter målsekvensen og molekylet merket med et fluorescerende fargestoff.
3. Til slutt produserer spaltningen av molekylet merket med et fluorescerende fargestoff fluorescerende signaler som er målbare.

Å bruke to gRNA-er (den ene var perfekt matchet og den andre hadde en enkelt mismatch) med enzymet enAsCas12a sikrer at hvis det er en mutasjon i ett av målstedene, vil det andre crRNAet fortsatt fungere kraftig, og fluorescenssignalet kan generere (Figur 5).

Figur 5.

Skjematisk av CRISPR-basert nukleotiddeteksjon (VaNGuard).

Gå til:

Konklusjon

Ett år etter at WHO erklærte COVID-19-utbruddet som en global pandemi, til tross for vaksineutrulling, raser sykdommen fortsatt over hele verden. I tillegg truer fremveksten av nye SARS-CoV-2-stammer med å gjøre pandemien langt verre. Ulike studier har vist at COVID-19 er ekstremt smittsomt og flertallet av smittede personer (>80 %) med SARS-CoV-2 er asymptomatiske eller har mild sykdom. Disse egenskapene (svært smittsomme virus og asymptomatiske pasienter og fremveksten av nye SARS-CoV-2-stammer) gjør at sykdommen kan spre seg over hele verden og føre til omfattende skader på helsesystemet og den globale økonomien. Derfor oppfordres de raske og spesifikke diagnostiske metodene for å identifisere infiserte individer og sette dem i karantene for å avbryte overføringssyklusen til dette dødelige viruset globalt. CRISPR-Cas-systemet, den mest populære genomredigeringsteknologien varsler en ny æra i diagnostisering av SARS-CoV-2. I motsetning til konvensjonelle laboratoriemetoder for å oppdage COVID-19 som RT-qPCR, Next Generation Sequencing (NGS), som krever høyt trente teknikere og dyre fasiliteter, og serologiske tester som gjenkjenner antistoffer spesifikke for SARS-CoV-2 i senere stadier av infeksjon ( når mulighetene for å behandle og begrense sykdomsoverføring har passert), har CRISPR-Cas-baserte metoder høy spesifisitet og sensitivitet, uten behov for dyrt utstyr (Tabell 1). Gitt den høye presisjonen, spesifisiteten, portabiliteten og minimale utstyrskravene til CRISPR-Cas-baserte metoder, ville de være ideelle for «enkle å utføre tester» som er ekstremt viktige for diagnose av Covid19, spesielt i utviklingsland eller til og med steder med større risiko for infeksjon som flyplasser, havner og akuttmottak. I denne gjennomgangen har vi oppsummert CRISPR-baserte diagnostiske metoder, inkludert CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12, CRIS PR-Cas13 og CRISPR-Cas3, i utviklingen av raske, nøyaktige og bærbare diagnostiske tester i COVID-19.

Tabell 1.

Sammendrag av COVID-19-deteksjonsmetoder basert på CRISPR/Cas

Åpne i et eget vindu

Gå til:

Fotnoter

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Finansiering:

Ikke aktuelt.

Gå til:

Referanser

1. 

Organisasjon WH . Koronavirussykdom (COVID-19) . 2020. [ Google Scholar ]2. 

Park SE. Epidemiologi, virologi og kliniske trekk ved alvorlig akutt respiratorisk syndrom-coronavirus-2 (SARSCoV-2; Coronavirus Disease-19) . Clin Exp Pediatr 2020; 63 ( 4 ):119–24. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]3. 

Rothan HA, Byrareddy SN. Epidemiologien og patogenesen til utbruddet av koronavirussykdom (COVID-19) . J Autoimmun 2020:102433. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]4. 

Velavan TP, Meyer CG. COVID-19-epidemien . Trop Med Int Health 2020. mars; 25 ( 3 ):278–80. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]5. 

Coronaviridae-studiegruppe for den internasjonale komiteen for taksonomi av virus. Arten alvorlig akutt respiratorisk syndrom-relatert koronavirus: klassifisering av 2019-nCoV og navngi den SARS-CoV-2 . Nat Microbiol 2020; 5 ( 4 ): 536–44. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]6. 

Kumar V. Nye menneskelige koronavirusinfeksjoner (SARS, MERS og COVID-19): hvor de leder oss . Int Rev Immunol 2021; 40 ( 1–2 ):5–53. [ PubMed ] [ Google Scholar ]7. 

Buonaguro FM, Ascierto PA, Morse GD, Buonaguro L, Puzanov I, Tornesello ML, et al. Covid-19: tid for et paradigmeskifte . Rev Medl Virol 2020; 30 ( 5 ): e2134. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]8. 

Hamed MA. En oversikt over COVID-19: virkelighet og forventninger . Bull Natl Res Cent 2020; 44 ( 1 ):86. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]9. 

Javalkote VS, Kancharla N, Bhadra B, Shukla M, Soni B, Sapre A, et al. CRISPR-baserte analyser for rask påvisning av SARS-CoV-2 . Fortrykk. 2020. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]10. 

Ullah M, Ibrar M, Uddin Khan S, Ullah H, Ali Khan N. COVID-19-deteksjon: Sammenligning og nøyaktighet av flere diagnostiske tester . Novel Research in Microbiology Journal 2020; 4 ( 4 ):868-83. [ Google Scholar ]11. 

Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, Shibumura S, Yamauchi Y, Yamamoto M, et al. Rask og nøyaktig påvisning av det nye koronaviruset SARS-CoV-2 ved hjelp av CRISPR-Cas3 . medRxiv . 2020. [ Google Scholar ]12. 

Ebrahimi S, Makvandi M, Abbasi S, Azadmanesh K, Teimoori A. Utvikling av onkolytisk Herpes simplex-virus type 1 til UL39 knockout av CRISPR-Cas9 . Iran J Basic Med Sci 2020; 23 ( 7 ):937–44. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]13. 

Ebrahimi S, Teimoori A, Khanbabaei H, Tabasi M. Utnyttelse av CRISPR/Cas 9-system for manipulering av DNA-virusgenom . Rev Med Virol 2019; 29 ( 1 ):e2009. [ PubMed ] [ Google Scholar ]14. 

Richter C, Chang JT, Fineran PC. Funksjon og regulering av grupperte, regelmessige, korte palindromiske gjentakelser (CRISPR)/CRISPR-tilknyttede (Cas) systemer . Virus 2012; 4 ( 10 ):2291-311. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]15. 

Wang M, Zhang R, Li J. CRISPR/cas-systemer omdefinerer nukleinsyredeteksjon: Prinsipper og metoder . Biosens Bioelectron 2020:112430. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]16. 

Qomi SB, Asghari A, Mojarrad M. En oversikt over det CRISPR-baserte genomiske- og epigenomredigeringssystemet: funksjon, applikasjoner og utfordringer . Adv Biomed Res 2019; 8:49 . [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]17. 

Kim JS, Cho DH, Park M, Chung WJ, Shin D, Ko KS, et al. CRISPR/Cas9-mediert re-sensibilisering av antibiotika-resistente Escherichia coli som huser utvidede spektrum β-laktamaser . J Microbiol Biotechnol 2016; 26 ( 2 ):394-401. [ PubMed ] [ Google Scholar ]18. 

Kostyushev D, Brezgin S, Kostyusheva A, Zarifyan D, Goptar I, Chulanov V. Orthologous CRISPR/Cas9-systemer for spesifikk og effektiv nedbrytning av kovalent lukket sirkulært DNA fra hepatitt B-virus . Cell Mol Life Sci 2019; 76 ( 9 ):1779-94. [ PubMed ] [ Google Scholar ]19. 

Liu X, Duan X, Holmes JA, Li W, Lee SH, Tu Z, et al. Et nytt lncRNA regulerer HCV-infeksjon gjennom IFI6 . Hepatologi 2019; 69 ( 3 ):1004. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]20. 

Seeger C, Sohn JA. Målretting mot hepatitt B-virus med CRISPR/Cas9 . Mol Ther Nucleic Acids 2014; 3 ( 12 ): e216. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]21. 

Mohammadzadeh I, Qujeq D, Yousefi T, Ferns GA, Maniati M, Vaghari-Tabari M. CRISPR/Cas9-genredigering: En ny terapeutisk tilnærming i behandlingen av infeksjon og autoimmunitet . IUBMB Life 2020; 72 ( 8 ): 1603–21. [ PubMed ] [ Google Scholar ]22. 

Strich JR, Chertow DS. CRISPR-Cas biologi og dens anvendelse på infeksjonssykdommer . J Clin Microbiol 2019; 57 ( 4 ):e01307–18. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]23. 

Liu TY, Doudna JA. Kjemi av klasse 1 CRISPR-Cas effektorer: Binding, redigering og regulering . J Bioll Chem 2020; 295 ( 42 ):14473-87. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]24. 

Paul D, Naik P, Roy S. Utvikler en molekylær test for å oppdage SARS-CoV-2 . Transaksjoner fra Indian National Academy of Engineering 2020; 5 ( 2 ): 229–32. [ Google Scholar ]25. 

Weissleder R, Lee H, Ko J, Pittet MJ. COVID-19-diagnostikk i sammenheng . Sci Transl Med 2020; 12 ( 546 ):eabc1931. [ PubMed ] [ Google Scholar ]26. 

Joung J, Ladha A, Saito M, Kim NG, Woolley AE, Segel M, et al. Påvisning av SARS-CoV-2 med SHERLOCK-testing med én pott . N Engl J Med 2020; 383 ( 15 ): 1492–4. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]27. 

Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. SHERLOCK: nukleinsyredeteksjon med CRISPR-nukleaser . Nat Protoc 2019; 14 ( 10 ):2986-3012. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]28. 

Xiang X, Qian K, Zhang Z, Lin F, Xie Y, Liu Y, et al. CRISPR-cas-systembasert molekylærdiagnostisk verktøy for infeksjonssykdommer og ny lungebetennelse i 2019 med coronavirus (COVID-19) . J Drug Target 2020; 28 ( 7–8 ): 727–731. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]29. 

Goudarzi KA, Nematollahi MH, Khanbabaei H, Nave HH, Mirzaei HR, Pourghadamyari H, et al. Målrettet levering av CRISPR/Cas13 som en lovende terapeutisk tilnærming til behandling av SARS-CoV-2 . Curr Pharm Biotechnol 2020. Online i forkant av trykk. [ PubMed ] [ Google Scholar ]30. 

Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, et al. CRISPR–Cas12-basert påvisning av SARSCoV-2 . Nat Biotechnol 2020; 38 ( 7 ):870-4. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]31. 

Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, et al. CRISPR-Cas12a-målbinding frigjør vilkårlig enkeltstrenget DNase-aktivitet . Vitenskap 2018; 360 ( 6387 ):436–9. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]32. 

Jolany Vangah S, Katalani C, Booneh HA, Hajizade A, Sijercic A, Ahmadian G. CRISPR-basert diagnose av smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer . Biol Proced Online 2020; 22:22 . [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]33. 

Zhang F, Abudayyeh OO, Gootenberg JS. En protokoll for påvisning av COVID-19 ved hjelp av CRISPR-diagnostikk. En protokoll for påvisning av COVID-19 ved hjelp av CRISPR-diagnostikk . Synthego 2020;8. [ Google Scholar ]34. 

Azhar M, Phutela R, Ansari AH, Sinha D, Sharma N, Kumar M, et al. Rask, feltdistribuerbar nukleobasedeteksjon og identifikasjon ved hjelp av FnCas9 . bioRxiv . 2020. [ Google Scholar ]35. 

Ooi KH, Liu MM, Tay JWD, Teo SY, Kaewsapsak P, Jin S, et al. En konstruert CRISPR-Cas12a-variant og DNA-RNA-hybridguider muliggjør robust og rask COVID-19-testing . Nat Commun 2021; 12 ( 1 ):1739. [ PMC gratis artikkel ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]36. 

Ooi KH, Tay JWD, Teo SY, Liu MM, Kaewsapsak P, Jin S, et al. En CRISPR-basert SARS-CoV-2 diagnostisk analyse som er robust mot viral evolusjon og RNA-redigering . bioRxiv . 2020. [ Google Scholar ]